組成及試劑配制:
1、酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復顛倒/搓動以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標準品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標準品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
注意事項：1．基礎(chǔ)程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產(chǎn)物；9．PCR反應體系與反應條件。

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實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應目的基因的特異引物（在PCR反應中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應應該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行設(shè)立一個的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
４．PCR試劑配制應使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準備
從試劑盒中取出熒光PCR反應液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個測試反應體系配制如下表：
試劑 每個反應加入的量 N個反應加入的量
熒光PCR反應液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計算好各試劑的使用量，加入一適當體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個PCR反應管中分別加入15μL熒光PCR反應液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時離心10秒。
7.2 qPCR反應條件
將各反應管放入定量PCR儀器的反應槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時收集熒光信號。報告基團：設(shè)置為FAM。淬滅基團：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
1,3-Dibromobenzene煙酸乙酯 99%1,2,4-三氮唑 99%

2,2'-Biphel3-哌啶甲酸乙酯 98%1,2,4-三氮唑 分析標準品

DMB4-氯甲酰基丁酸甲酯 98%硫酸釹 SP

Biphenyl4'-羥基苯戊酮 98%硫酸釹 99.99%

Iodobenzene5-甲基異噁唑-4-甲酸 98%氯化鐠 99.99% metals basis

4-Methoxyazobenzene3-氨基-4-甲基噻吩-2-甲酸甲酯 98%氯化鐠 99.9% metals basis

1,3,5-Tribromobenzene10-甲氧基亞氨基芪 98%氯化鋱,六 99.9% metals basis

Ethyl benzene3-甲氨基  98%氯化鋱,六 99.999% metals basis

Pseudocumol3-甲氨基胺 98%二烷  96%

DAN奧卡西平 98%胡椒 CP,99.0%（易制）

1,4-Dihydroxynaphthalene4-吡啶乙酸鹽酸鹽 98%3'-氨基苯乙酮 97%

1,5-Dihydroxynaphthalene二氯化磷酸苯酯 98%3-溴代苯乙酮 98%

1-Bromonaphthalene3-吡啶乙酸鹽酸鹽 99%2,4-二甲 97%

Zinc3,4,5-*氧基苯乙 97%對氨基苯乙 98%

Zinc1,2,3,4-四氫-1-萘胺  98%亞氨基二乙 95%

Zinc3,4,5-*氧基 98%亞鐵化鈉 AR

異硫酸1-萘酯(>98.0%(GC))Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific)KCNMB1/Maxi Potassium channel beta  鈣激活通道蛋白β1抗體

(>98.0%(GC))Olfm4 (D6Y5A) XP® Rabbit mAb (Mouse Specific)KCNK9/KCNK3  酸敏感離子通道蛋白3抗體

3,5-二甲酰氯(>99.0%(T))p56Dok-2 AntibodyKCNK  TWIK相關(guān)酸敏感離子通道蛋白9抗體

2,4-二肼鹽酸鹽(>98.0%(HPLC)(T))CD45 (HI30) Mouse mAb (redFluor™ 710 Conjugate)KCNJ5  G蛋白激活內(nèi)向通道5抗體

O-4-硝基芐基羥胺鹽酸鹽(>99.0%(HPLC),用于高效液相色譜標記)DDR1 AntibodyKCNH1/EAG1  離子通道蛋白EAG1抗體

氮苯磺酰肼(>99.0%(HPLC),用于高效液相色譜標記)PhosphoPlus® mTOR (Ser2448) Antibody DuetKCNG4/KV6.3  離子通道蛋白G蛋白4抗體

7-乙酰氧基-4-溴甲基(>98.0%(HPLC)(T),用于高效液相色譜標)Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135) (DA7A8) Rabbit mAbKCNG2  心臟離子通道蛋白亞基2抗體

Br-Mmc (=4-溴甲基-7-甲氧基)(>98.0%(T))Phospho-IGF-I Receptor β (Tyr1135) (DA7A8) Rabbit mAbKCNE2  離子通道蛋白家族成員2抗體

3-溴甲基-7-甲氧基-1,4-苯并惡-2-酮(>98.0%(T))Phospho-PSD95 (Tyr236/Tyr240) AntibodyKCNE1L  離子通道蛋白家族成員1樣蛋白抗體

DBD-PZ [=4-(N,N-二甲氨基磺酰基)-7-哌-2,1,3-苯并惡二唑](>98.0%(HPLC))Bag1 (3.10G3E2) Mouse mAbKCNE1  離子通道蛋白家族成員1抗體
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